分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测定都采用分光光度法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。
在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以朗伯-比尔定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。波长范围：
1、200～400nm的紫外光区
2、400～760nm的可见光区
3、2.5～25μm(按波数计为4000cm-1～400cm-1)的红外光区。
检测仪器为分光光度计。依据光谱区，分光光度计可分为：紫外分光光度计，可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计。如果吸光质点是原子，其仪器称为原子吸收分光光度计。各种分光光度计的基本组成是：光源系统、分光系统、吸收系统和检测系统。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程，定期进行校正检定。
利用分光光度法对物质进行定量测定，主要有以下几种方法：
1、标准管法
将待测溶液与已知浓度的标准溶液在相同条件下分别测定A值，然后按下式求得待测溶液中物质的含量。
CT=（AT/AS）*CS
2、标准曲线法
先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测定出它们的A值，以A值为横坐标，浓度为纵坐标，作标准曲线（A~c工作曲线），可以求出标准曲线的回归方程。在测定待测溶液时，操作条件应与制作标准曲线时相同，以待测液的A值从标准曲线上查出（得到）该样品的相应浓度。
3、吸光系数法
当某物质溶液的浓度为1mol/L，厚度为1cm时，溶液对某波长的吸光度称为该物质的摩尔吸光系数，以ε表示。ε值可通过实验测得，也可由手册中查出。例如亚铁氮二杂菲配合物的ε值 等于11000 L/cm·mol
已知某物质ε值，只要测出其A值再根据下式便可求得样品的浓度：c=A/ε。
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